聽老(lǎo)師(shī)將(jiāng)講HPLC的(dí)計算

                                                           檢(jiǎn)碩(shuò)科學(xué)器(qì)材(cái)（上海(hǎi)）有限公司(sī)

HPLC中涉及到計算的，主要(yào)是流(liú)動相(xiāng)配製和(hé)含量計(jì)算。RP-HPLC一般用緩(huǎn)衝(chōng)鹽(yán)配合甲醇乙腈(jīng)作(zuò)為(wéi)流(liú)動(dòng)相，計算主(zhǔ)要涉及到如何(hé)配製(zhì)流動(dòng)相(xiāng)的(dí)問題。同時(shí)還(huán)要考慮(lǜ)到(dào)流動相(xiāng)配(pèi)製的數量(liáng)問題。HPLC計(jì)算主要運(yùn)用外標法。內標法在HPLC分析中，運用不多。所(suǒ)以(yǐ)略講(jiǎng)。

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，流動(dòng)相(xiāng)配製的(dí)計算(suàn)

流動相在HPLC中起到(dào)運輸樣品的作用。而流動相準確地(dì)配製(zhì)，在(zài)HPLC測試中有(yǒu)著重(zhòng)要(yào)的作(zuò)用(yòng)。準(zhǔn)確(què)地配製流(liú)動(dòng)相(xiāng)能夠保證測(cè)試(shì)中保留時(shí)間的重(zhòng)復(fù)性(xìng)。所(suǒ)以，配製起來(lái)不(bù)能掉以輕心(xīn)。

對於流(liú)動(dòng)相(xiāng)配製，我把它(tā)概(gài)括(kuò)為以(yǐ)下幾個(gè)字(zì)。

計(jì)算，稱(chēng)量(liáng)，溶(róng)解，調節(jié)，<混(hùn)合>，過濾(lǜ)，脫氣(qì)。為什麼我把“混合(hé)"外加了個框呢？這就是(shì)涉(shè)及(jí)到(dào)你的設備是否(fǒu)是(shì)單(dān)元(yuán)泵還是(shì)多元泵(bèng)的(dí)問題了。如果(guǒ)隻有一台(tái)單元(yuán)泵(bèng)，也(yě)無電(diàn)磁(cí)閥切換(huàn)功能(néng)的泵，需(xū)要混合這(zhè)個步(bù)驟，而多元泵(bèng)，或者(zhě)低壓梯(tī)度切換(huàn)的，可以(yǐ)不需要(yào)所謂的(dí)混合(hé)。各走各的。

打(dǎ)個(gè)比方說，如果(guǒ)我(wǒ)的流(liú)動相是：甲醇(chún)：純(chún)水=60：40（v/v），對於(yú)單(dān)元(yuán)泵，那麼隻能(néng)甲醇和(hé)純(chún)水(shuǐ)混合，作(zuò)為(wéi)流(liú)動相，而多(duō)元(yuán)泵或者多元(yuán)梯度(dù)泵(bèng)，則(zé)可(kě)以有兩(liǎng)路(lù)，A路放甲(jiǎ)醇， B路(lù)放純(chún)水(shuǐ)，A與(yǔ)B各(gè)比(bǐ)例(lì)控製(zhì)為(wéi)60%，和(hé)40%。

對於(yú)HPLC 配製流動相，要保證流(liú)動性配(pèi)製(zhì)準確(què)，也要(yào)保證(zhèng)流(liú)動(dòng)相(xiāng)配製(zhì)足(zú)量，不多不(bù)少(shǎo)，這樣(yàng)保證(zhèng)在(zài)這(zhè)批測試中，流動(dòng)相不(bù)至於(yú)不夠，也(yě)不致於太(tài)多而浪費，流動相(xiāng)一(yī)般(bān)需(xū)要在2-3天(tiān)內用(yòng)完。那麼首先確定流動相(xiāng)要配製(zhì)多少(shǎo)。舉一(yī)個(gè)例(lì)子。

例(lì)

要(yào)分析(xī)30個(gè)樣(yàng)品(pǐn)，10個(gè)對照品，樣(yàng)品(pǐn)和(hé)對照(zhào)品都分(fēn)析2次。一個試(shì)樣(yàng)分析20分鐘，流(liú)速為1.2ml/min。那麼我要配(pèi)製(zhì)多少(shǎo)ml的流動相(xiāng)呢？通(tōng)過(guò)計算來解(jiě)決(jué)。（注(zhù)：自(zì)動進(jìn)樣，連夜分析(xī)，可以設置停止泵(bèng)程序）

一般(bān)來說(shuō)，試樣設(shè)置20分鐘(zhōng)，還需(xū)要考慮(lǜ)進樣的(dí)時(shí)間(jiān)。假(jiǎ)設進樣時(shí)間為三分(fēn)鐘(zhōng)，那麼(mó)一個(gè)試(shì)樣所需(xū)要的時間(jiān)為(wéi)23分(fēn)鐘。我(wǒ)們(mén)可(kě)以計算：

根(gēn)據計算，需要配(pèi)製(zhì)2208ml流(liú)動相(xiāng)。對於(yú)流動(dòng)相(xiāng)，我(wǒ)們(mén)不能配製得太摳(kōu)，需(xū)要(yào)考慮到吸(xī)濾頭(tóu)占的空間，那(nà)麼我們(mén)再多配製個(gè)100-300ml，這取(qǔ)決於你的瓶底胖瘦(shòu)。能夠保證(zhèng)不(bù)被吸(xī)空為宜。那麼(mó)我們就(jiù)配(pèi)製(zhì)2500ml吧。

對於流動相如何(hé)配製，我們(mén)給一個(gè)實(shí)例

比(bǐ)如我(wǒ)要(yào)測試中藥一清(qīng)膠囊，我(wǒ)們(mén)翻(fān)閱(yuè)中國(guó)藥(yào)典，得以(yǐ)下信息。

一清顆粒是由黃連，大黃，黃芩（qin）組(zǔ)成(chéng)。一般(bān)用(yòng)於清熱瀉火(huǒ)解毒(dú)，化瘀涼血止血。用(yòng)於火毒(dú)血熱所導致的(dí)身熱煩躁(zào)，目(mù)赤口(kǒu)瘡(chuāng)，咽喉牙齦腫(zhǒng)痛(tòng)，大便秘結，吐血(xiě)，咯血咽(yān)喉炎(yán)，扁桃體炎，牙齦炎等(děng)上述症(zhèng)候(hòu)者。

其(qí)中黃芩主(zhǔ)要成(chéng)分黃芩苷用(yòng)HPLC方(fāng)法測(cè)試。先摘(zhāi)入如下(xià)：

色譜條件與係統(tǒng)適(shì)應性試驗以(yǐ)十八(bā)烷基(jī)矽(guī)烷鍵合(hé)矽膠為填充(chōng)劑(jì)，以(yǐ)甲醇(chún)-0.2mol/L磷(lín)酸二(èr)氫鈉(nà)溶(róng)液（pH=2.7）(42:58 v/v)為流動相(xiāng)，檢測波(bō)長(cháng)為275nm。有效塔(tǎ)板數(shù)按(àn)黃芩(qín)苷峰計算不低於5000

我(wǒ)們(mén)看到，其(qí)流動相是(shì)：甲醇-0.2mol/L磷(lín)酸(suān)二(èr)氫鈉溶(róng)液(yè)（pH=2.7）(42:58 v/v)，那麼也(yě)就(jiù)是(shì)說有(yǒu)水(shuǐ)相(xiāng)識0.2mol/L磷酸(suān)二(èr)氫鈉(nà)溶(róng)液，其pH=2.7（用磷(lín)酸調節），有(yǒu)機相(xiāng)是甲醇。

要注意，對於HPLC用(yòng)的試劑，水(shuǐ)，溶劑(jì)，都是需(xū)要好的。試劑(jì)一般在(zài)分(fēn)析純以(yǐ)上。最好(hǎo)用(yòng)優(yōu)級(jí)純，溶(róng)劑一般(bān)用HPLC級別(bié)。水用超(chāo)純水。所有的(dí)溶(róng)劑，溶液，都(dū)需要(yào)用(yòng)0.45微米（或更細）的(dí)微孔濾(lǜ)膜濾過。也要(yào)保(bǎo)證溶(róng)劑(jì)瓶(píng)清洗幹淨(jìng)。幹(gān)燥(zào)。

流動相脫氣是(shì)很重要的，現在(zài)一般的儀器都有在綫脫氣(qì)。當(dāng)然(rán)，在配製(zhì)流動相前脫氣，亦(yì)重要(yào)。一(yī)般(bān)脫氣(qì)又抽(chōu)真空(kōng)脫氣，超聲波(bō)脫(tuō)氣(qì)，吹He脫氣，加(jiā)熱(rè)回流(liú)脫氣等。常(cháng)用的是前兩個脫(tuō)氣(qì)方法。當然(rán)，抽真空(kōng)脫氣(qì)效(xiào)率(shuài)比較(jiào)高，但(dàn)是要注意有(yǒu)機相(xiāng)是(shì)否(fǒu)在(zài)抽真(zhēn)空後比例改變的問(wèn)題。所(suǒ)以，對於混合兩相的(dí)流動相(xiāng)，最好單(dān)獨濾過，再(zài)混合。混合後一(yī)般會產生氣體(tǐ)，用效(xiào)率略低(dī)的超聲波(bō)脫氣即可。超(chāo)聲波脫氣，隻要(yào)看(kàn)到(dào)無明(míng)顯(xiǎn)氣(qì)泡(pào)即(jí)可(kě)使(shǐ)用。

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二．含量計算

對(duì)於HPLC，我們一般使(shǐ)用(yòng)外(wài)標法計算(suàn)。那麼有同學問，那(nà)麼(mó)為什(shí)麼(mó)內標法(fǎ)很少在HPLC上使用(yòng)呢?

那(nà)麼(mó)我(wǒ)們看(kàn)下(xià)氣相色譜和HPLC不同的(dí)進樣(yàng)方式。GC手動進(jìn)樣還(huán)是(shì)依靠(kào)進樣針(zhēn)的(dí)定量進樣(yàng)，因為(wéi)進樣量(liáng)很少(shǎo)，以微(wēi)升計(jì)，所以(yǐ)，稍(shāo)稍(shāo)不(bù)留(liú)神(shén)，就有(yǒu)可(kě)能多進或(huò)者少(shǎo)進樣。而(ér)且，進(jìn)樣針上的刻度也很粗(cū)，所以，GC用(yòng)手(shǒu)動進(jìn)樣(yàng)，使用(yòng)外標(biāo)法確實(shí)很考驗測試(shì)者的(dí)嫻(xián)熟(shú)技巧(qiǎo)和過人的(dí)眼力(lì)。而(ér)內(nèi)標法在GC進(jìn)樣(yàng)測(cè)試中，由(yóu)於內(nèi)標物的(dí)調(tiáo)節(jié)作用(yòng)，可以使得由(yóu)於進樣誤(wù)差降(jiàng)低(dī)到(dào)最小，其(qí)相關(guān)的文(wén)章，查(chá)閱qinqingcao在本論(lùn)壇的文章。但(dàn)是HPLC進(jìn)樣是六(liù)通(tōng)閥進樣，其有一根定量(liáng)環(huán)，如(rú)果手(shǒu)動進樣(yàng)能夠(gòu)保證定量(liáng)環是充(chōng)滿(mǎn)樣品溶液(yè)的(dí)，那(nà)麼進樣(yàng)誤(wù)差就(jiù)幾(jī)乎(hū)不(bù)存在(zài)。況且(qiě)內標法需(xū)要(yào)尋找(zhǎo)合適(shì)的內標物質(zhì)，同(tóng)時配製內標物(wù)，比較麻(má)煩(fán)，所以在(zài)HPLC中(zhōng)很少(shǎo)聽說用內標法(fǎ)定(dìng)量計算(suàn)。更多的(dí)，是使(shǐ)用外標法計算。

所以，HPLC手動進(jìn)樣一(yī)般使用(yòng)3倍量的定(dìng)量環進(jìn)樣。也就是說，20微升(shēng)的定量(liáng)環，我要注入(rù)60微升(shēng)以上(shàng)的樣品(pǐn)溶(róng)液(yè)。保證(zhèng)定量環中充滿(mǎn)著樣(yàng)品溶液(yè)。而多餘的樣品(pǐn)溶液會(huì)被排除。這(zhè)樣(yàng)保證每次進(jìn)樣都是(shì)定量(liáng)環中(zhōng)的(dí)那(nà)些量。對(duì)於定(dìng)量環，這個體積(jī)一般也不是(shì)正好是20.00微(wēi)升，但是(shì)我們保證(zhèng)進樣(yàng)過量(liáng)（多餘的(dí)溶液會被(bèi)排出），則能(néng)夠(gòu)保證進樣(yàng)都是按(àn)照(zhào)定量(liáng)環中(zhōng)的(dí)體積(jī)進入(rù)色(sè)譜係統，這(zhè)樣消(xiāo)除(chú)進樣的誤差(chà)。對於定量環，在(zài)做(zuò)完樣品(pǐn)後需要(yào)用無溶質的(dí)流動相清(qīng)洗(xǐ)數遍(biàn)。如果(guǒ)定量(liáng)環(huán)真(zhēn)的很(hěn)髒，無法清洗了，那(nà)麼可以裁(cái)剪(jiǎn)一(yī)段管(guǎn)徑和(hé)定(dìng)量(liáng)環相同的幹(gān)淨的(dí)不鏽(xiù)鋼管，裁剪長度(dù)和定量管(guǎn)相同，安裝(zhuāng)上去。當然資(zī)金充(chōng)裕(yù)的話，也(yě)可(kě)以(yǐ)購買(mǎi)廠家(jiā)的(dí)定量(liáng)環。

當然(rán)現在(zài)自動進(jìn)樣(yàng)器很普(pǔ)及(jí)，那麼(mó)使用自(zì)動進(jìn)樣(yàng)器(qì)就更(gēng)加(jiā)方(fāng)便了(liǎo)。

對(duì)於外(wài)標法(fǎ)，實際上(shàng)也(yě)就(jiù)是用(yòng)已知濃度(dù)的(dí)對(duì)照(zhào)品（標準(zhǔn)品(pǐn)）來對(duì)樣品(pǐn)中(zhōng)的(dí)該物質(zhì)。這(zhè)實(shí)際(jì)上(shàng)很象砝碼(mǎ)和(hé)天平。標準(zhǔn)品(pǐn)就如同(tóng)砝碼，在同樣的色譜(pǔ)條件下(xià)，標(biāo)準品的(dí)峰(fēng)麵積和濃度已知，而樣(yàng)品(pǐn)中(zhōng)的峰麵(miàn)積(jī)可以(yǐ)測(cè)試(shì)出來，這(zhè)樣(yàng)通過(guò)比例(lì)式子比較(jiào)出樣品中(zhōng)該物質的(dí)濃度(dù)了。

在這裏，我想和大(dà)家(jiā)說明的是，一(yī)般(bān)是通(tōng)過保留時間做(zuò)定性(xìng)的(dí)。比方說(shuō)，我測試維生(shēng)素(sù)C，維(wéi)生素(sù)C標(biāo)準品(pǐn)在(zài)一(yī)定的色(sè)譜(pǔ)條(tiáo)件下，其保留時間(jiān)為2.4分(fēn)鐘；樣品在同樣的色(sè)譜(pǔ)條(tiáo)件(jiàn)下，2.4分鐘(zhōng)有峰，一(yī)般(bān)認(rèn)為(wéi)是(shì)樣(yàng)品中也許有維生(shēng)素(sù)C。當然(rán)，保(bǎo)留時間定(dìng)性確實(shí)有其局(jú)限(xiàn)，但是沒有(yǒu)其他手段，那麼保留(liú)時間還是能(néng)夠發(fā)揮(huī)定性的作用。

對(duì)於定(dìng)量，外標法定(dìng)量，如果做(zuò)的準確(què)的話，需要(yào)用多點(diǎn)（濃度(dù)）定量。然而在(zài)企(qǐ)業(yè)用(yòng)單點(diǎn)法(fǎ)定量(liáng)還是(shì)很多的(dí)。對於做(zuò)綫性，精密(mì)度，回(huí)收率，這些(xiē)內容我們在方法(fǎ)學驗證中講(jiǎng)授，這(zhè)裏我還是著重講(jiǎng)解單(dān)點法校(xiào)正(zhèng)。

在講單(dān)點法校正，我(wǒ)先(xiān)問同學們一(yī)個問題，如何用簡單(dān)的(dí)方(fāng)法來(lái)測(cè)試(shì)校(xiào)園中的樹高度(dù)？

通(tōng)過一(yī)根已知高(gāo)度的biao杆(gān)，在(zài)太陽下投(tóu)射在地(dì)麵的(dí)陰影(yǐng)的(dí)長(cháng)度，計算(suàn)出樹的高度(dù)。同樣道(dào)理(lǐ)，我(wǒ)們也(yě)是(shì)用已知(zhī)的標準(zhǔn)品(pǐn)的(dí)濃(nóng)度和峰麵(miàn)積，用樣品(pǐn)中同(tóng)一物(wù)質(zhì)的麵積，計(jì)算出樣品中的那(nà)個物質的濃(nóng)度(dù)。根據(jù)稀釋(shì)倍數計算出樣品(pǐn)中，該(gāi)物(wù)質的含量。

如果與標準(zhǔn)曲(qū)綫聯係起(qǐ)來，這個(gè)就是單點法。也就是(shì)說(shuō)，以(yǐ)0為(wéi)圓(yuán)心(xīn)，標(biāo)準品(pǐn)濃度(dù)和麵(miàn)積在二元坐標的(dí)一點的連綫作為校準(zhǔn)曲綫。得y=ax 其中(zhōng)的a就是(shì)斜率(shuài)，也(yě)就是麵積隨著濃(nóng)度(dù)的(dí)變(biàn)化而(ér)變(biàn)化(huà)，其變(biàn)化(huà)率為a。

那(nà)麼樣品濃度(dù)的(dí)計算，就是按照其峰麵積在(zài)坐(zuò)標(biāo)上的點(diǎn)，對應的濃(nóng)度(dù)。用(yòng)以下公式計算。

單點法：

我(wǒ)們給出一(yī)個例題(tí)。

例

測試果(guǒ)汁(zhī)中(zhōng)維(wéi)生(shēng)素(sù)C含量。配(pèi)製20mg/100ml的維生(shēng)素C作為標(biāo)準品(pǐn)。稱取20.005g果汁(zhī)到50ml容量瓶中，加(jiā)入(rù)流(liú)動相(xiāng)溶解(jiě)定容搖匀。濾(lǜ)紙過濾(lǜ)。吸取(qǔ)濾液10ml到50ml容量瓶(píng)中。流(liú)動(dòng)相定(dìng)容(róng)搖匀(yún)。標(biāo)準品(pǐn)和樣品(pǐn)均吸取20μl進色譜，分別得到峰(fēng)麵(miàn)積(jī)24336（標準品(pǐn)），20129（樣(yàng)品）。計算(suàn)果汁(zhī)中(zhōng)維(wéi)生素C含量（mg/100g）

                                                                                                                                       本篇(piān)轉(zhuǎn)載至液(yè)相(xiāng)色(sè)譜(pǔ)之家(jiā)